Deoxynojirimycin (1-DNJ) là một polyhydroxy alkaloid giống piperidin được chiết xuất từ lá dâu tằm. Tên hóa học của nó (2R, 3R, 4R, 5S) -2-hydroxymethyl-piperidine-3,4,5-triol, với công thức phân tử C6H13NO4 và trọng lượng phân tử 163.17. DNJ lần đầu tiên được phân lập và tinh chế từ vỏ rễ Dâu tằm bởi học giả Nhật Bản Yoshiaki và cộng sự vào năm 1976. Ngoài Mulberry, 1-DNJ và các chất tương tự của nó cũng được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc họ Commelinaceae, hyacinth và Psammophyllum, nhưng hàm lượng của chúng thấp hơn của Mulberry. DNJ có cấu trúc tương tự như α-1, 4-glucose và là một chất ức chế α -glucosidase mạnh mẽ, được phát hiện có tác dụng hạ đường huyết, tiêu thũng và chống oxy hóa tốt.
Nguồn DNJ
DNJ được chiết xuất từ thực vật và vi sinh vật. Theo các tài liệu báo cáo cho đến nay, Chiết xuất lá dâu có hàm lượng DNJ dồi dào nhất, và DNJ do vi sinh vật phân lập chủ yếu đến từ Streptomyces và Bacillus. Hầu như tất cả các bộ phận của dâu tằm đều có chứa DNJ, nhưng hàm lượng DNJ thay đổi theo loài, khu vực canh tác, thời gian hái và địa điểm hái. Ngoài ra, nó cũng được phân lập từ các thực vật như Commelianceae, hyacinth, Radix Platycodontidae, và Pyrrhaceae. Sugiyama Makoto và cộng sự. DNJ lần đầu tiên phân lập sản xuất Streptomyces SEN-158 và GC-148148 (Strep Tomyces Lavendulae) từ đất. DNJ cũng có thể được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp. Bảng sau đây cho thấy hàm lượng DNJ ở các loài thực vật khác nhau.
Cây Cối Gia đình Phần chứa DNJ Nội dung của DNJ Trái dâu Họ Moraceae Chân răng
Chi nhánh
Leaf
0.624
0.0825-0.2382
0.08-0.344
Commelinacommunis hoang dã Commelanceae / 0.01125 Hyacinthus Thuộc họ hoa bìm bìm / Hyacinthaceae củ cải 0.0012 Psammophyllum Họ lục bình / 0.00086 Jacobinia suberecta Họ Acanthaceae lá /
Chiết xuất, tách và tinh chế DNJ
Các phương pháp chiết xuất DNJ từ Dâu tằm chủ yếu bao gồm chiết xuất bằng nước cất, chiết xuất bằng axit clohydric, tách nước khử ion, chiết xuất etanol và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng. Trong công nghệ tinh chế, hầu hết là phương pháp nhựa trao đổi cation, công nghệ tinh chế sắc ký ngược cũng là một nghiên cứu ít. 1-DNJ tồn tại trong tế bào và hòa tan trong nước. Các cấu trúc tế bào như thành tế bào cần phải bị phá hủy trước khi chiết xuất. Do đó, các phương pháp được hỗ trợ như vi sóng và siêu âm có lợi cho việc chiết xuất 1-DNJ. Các phương pháp cụ thể bao gồm:
- Lá dâu tằm giã nhỏ, cho vào chưng cách thủy đun hồi lưu. Sau 2-2.5h, dung dịch nước được lọc và chiết lại. Dung dịch chiết xuất được kết hợp hai lần, lọc, đun nóng và cô đặc, sau đó được tinh chế bằng nhựa trao đổi ion hóa.
- Tẩy với lượng nước 6 lần khử ion 3 lần, mỗi lần lần lượt là 3h, 2h và 1.5h. Sau ba lần cô đặc dịch lọc, một lượng bằng nhau của etanol 95% được thêm vào. Sau khi để yên trong 12 giờ, lọc kết tủa và thu hồi etanol bằng cách giải nén để thu được dịch chiết thô DNJ với tỷ lệ thu hồi là 95.98%.
- DNJ lần đầu tiên được chiết xuất bằng phương pháp khử ion bằng nước khử ion, và sau đó được tinh chế bằng nhựa trao đổi ion 732 (loại H). Mức phục hồi trung bình của DNJ là 96.1%.
- Lá dâu tằm được chiết xuất với 70% etanol, cô đặc, nhựa hấp phụ vĩ mô, nhựa trao đổi quá cation, nước cất, rửa giải amoniac 0.5mol / L, được tinh chế bằng silica gel sau khi cô đặc, kết hợp với các thành phần tinh khiết có chứa DNJ, cô đặc và làm khô chân không. Hàm lượng DNJ là 23.2% và tỷ lệ chiết xuất là 0.355%.
Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến tốc độ chiết xuất DNJ đã được so sánh. Các điều kiện chiết xuất tối ưu như sau: 65% ethanol làm tác nhân chiết, tỷ lệ rắn-lỏng 1: 8, nghiền tế bào tăng cường siêu âm 20 phút (1800W), tỷ lệ chiết xuất 95.8%; Được tinh chế bằng nhựa trao đổi cation, sản lượng DNJ là 124.54mg / 100g, và độ tinh khiết hơn 92.3%.
Một số học giả đã sử dụng phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng để chiết xuất 1-DNJ từ lá Dâu tằm. Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng là sự kết hợp giữa chiết xuất bằng vi sóng và chiết xuất bằng dung môi truyền thống. Thông qua lưỡng cực, chuyển động phân tử được tạo ra trong vật liệu hoặc dung môi, dẫn đến việc đốt nóng mẫu, và việc đốt nóng làm cho tế bào thực vật bay hơi và mất nước. Một kỹ thuật chiết xuất mới, trong đó hơi nước tạo ra sự giãn nở, cuối cùng khiến tế bào vỡ ra và giải phóng các thành phần hoạt tính của nó. Việc chiết xuất 1-DNJ bị ảnh hưởng bởi thời gian xử lý vi sóng, công suất, tỷ lệ rắn-lỏng và thời gian chiết xuất. Quá trình chiết xuất tối ưu như sau: tỷ lệ chiết xuất 1-DNJ là 0.024%, thời gian xử lý vi sóng là 1.5 phút, công suất là 406W, tỷ lệ rắn-lỏng là 1∶40 và thời gian chiết xuất là 2. So với công nghệ chiết truyền thống, phương pháp này có ưu điểm là nhiệt độ chiết thấp, số lần chiết ít hơn, không có quán tính nhiệt (dễ điều khiển), hiệu suất cao, tốn ít dung môi và giá thành rẻ.
Phương pháp phát hiện DNJ
1-DNJ thuộc loại alkaloid dạng piperidin, không chứa chất mang màu như vòng benzen, liên kết đôi và nhóm cacbonyl, đồng thời có khả năng hấp thụ ánh sáng thấp trong dải bước sóng UV nên không thể phát hiện bằng máy dò UV. Ngoài ra, cấu trúc của alkaloid piperidin chứa nhiều nhóm hydroxyl, độ phân cực phân tử lớn nên khó định tính bằng phương pháp đo quang phát hiện. Dụng cụ dùng trong đo quang phổ tử ngoại tương đối đơn giản nhưng có nhược điểm là độ nhạy thấp do sự giao thoa của các nhóm mang màu và các chất có màu khác.
Các phương pháp phát hiện thường được sử dụng đối với hàm lượng DNJ bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn xuất trước cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ kế, sắc ký lỏng hiệu năng cao-phép đo khúc xạ vi sai, phương pháp so màu muối Leipton, sắc ký thời tiết, v.v. Phạm vi tuyến tính của từng loại phương pháp phát hiện là khác nhau do sự khác biệt của các điều kiện sắc ký (xem bảng dưới đây). Trong số đó, phương pháp HPLC-ELDS thuận tiện, nhanh chóng và nhạy bén hơn cả. HPLC-ms / MS là một phương pháp xác định định lượng DNJ trong lá dâu tằm được phát triển bởi Nitra et al. Giới hạn phát hiện của nó (S / N = 3) là 75pg và giới hạn định lượng (S / N = 10) là 100pg, làm cho việc phát hiện nhạy hơn.
Các phương pháp phát hiện khác nhau và các thông số cụ thể của DNJ
Phương pháp xác định Chất dẫn xuất hoặc chất tạo màu Máy dò phạm vi tuyến tính / μg / ml Sắc ký lỏng hiệu năng cao Flo metoxyl clorua Máy dò huỳnh quang 0.567-34 Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC-ELDS) / Máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi 2.11-21.2 HPLC-DAD Flo metoxycacbonyl clorua Máy dò DAD 0.0163-0.3250 HPLC hiệu suất cao pha đảo ngược pha dẫn xuất trước cột Flo metoxycacbonyl clorua Máy dò huỳnh quang 0.5-60 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ngược Methyl 9-fluorenyl cloroformat Máy dò huỳnh quang 3.6-36 Sắc ký lỏng hiệu năng cao-phép đo khối phổ tứ cực song song / Nguồn ion hóa hóa học áp suất khí quyển 0.482-2.410 Sắc ký khí cột mao quản Acetyl axetat Với đầu dò ion ngọn lửa 0.01-10 Sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn xuất trước cột 6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinic carbamat Máy dò huỳnh quang 0.5-25 Sắc ký lỏng hiệu suất cao pha đảo ngược được dẫn xuất trước 9-flo metyl cloroformat Máy dò UV 2.0-60 Xác định quang phổ Dung dịch thử iốt-kali iốtua Máy quang phổ UV-vis 0.25-4 HPLC – MS / MS / Khối quang phổ kế 0.1-10 Sắc ký lỏng hiệu năng cao / Máy dò khúc xạ kế vi sai 5.0-400.0 Phép đo màu muối gỗ đỏ / Máy quang phổ tử ngoại 0.4-40.4
Lợi ích của DNJ
Hạ đường huyết
DNJ có cấu trúc tương tự như α-1, 4-glucose và có thể ức chế cạnh tranh sản xuất đường trong quá trình chuyển hóa của cơ thể, do đó nó có tác dụng hạ đường huyết và có thể được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng của nó, béo phì và các rối loạn chức năng liên quan.
Tác dụng hạ đường huyết của DNJ đã được nghiên cứu trên chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra, và phản ứng của chuột được quan sát bằng cách bổ sung DNJ và polysaccharide qua đường uống. Người ta nhận thấy rằng nồng độ glucose trong máu, glycated hemoglobin, triglycerid, aspartate aminotransferase và alanin aminotransferase giảm đáng kể, trọng lượng cơ thể, mức insulin huyết tương và lipoprotein mật độ cao tăng đáng kể ở những con chuột mắc bệnh tiểu đường được nuôi bằng hỗn hợp DNJ và polysaccharide. Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược cho thấy Sự biểu hiện của loại GCK, PEPCK và G-6-Pase trong gan và pdX-1, insulin-1 và insulin-2 trong tuyến tụy được điều chỉnh tích cực và tiêu cực bởi DNJ và thức ăn hỗn hợp polysaccharide. khu vực. Điều hòa và chuyển hóa glycogen gan và tạo gluconeogenesis. Do DNJ không có tác dụng của gốc tự do hydroxyl và gốc tự do superoxide nên không thể sửa chữa các tế bào β đảo nhỏ bị tổn thương nên chỉ có thể giảm glucose trong máu đến một mức nhất định chứ không thể trở về trạng thái ban đầu với sự hỗ trợ của polysaccharid.
Ức chế khối u
DNJ có thể ức chế đáng kể sự xâm lấn, di căn và kết dính tế bào của các tế bào B16F10, với tỷ lệ ức chế tương ứng là 50%, 35% và 60%. Hoạt động ức chế của MMP-2 và MMP-9 bị ức chế đáng kể ở 50μg / mL và đạt 20% ở 50μg / mL. Tỷ lệ ức chế biểu hiện mRNA MMP-2 và MMP-9 lần lượt là 60% và 28%. Không có ảnh hưởng đáng kể đến sự biểu hiện của mRNA TIMP1, nhưng sự biểu hiện của mRNA TIMP2 đã tăng 31%. Ngoài ra, DNJ làm tăng mức độ α -mannose bề mặt tế bào lên 49%, giảm mức độ oligosaccharide xuống 21% và mức độ methyl hóa 30%. Những kết quả này cho thấy DNJ có thể được sử dụng như một chất bổ trợ để ức chế sự di căn của tế bào ung thư.
Ức chế vi rút
Papandreou nhận thấy rằng nồng độ DNJ thấp có thể ức chế sự điều hòa capsid của HIV đối với sự dung hợp màng glycoprotein của CXCR4 và do đó ức chế sự phá hủy của HIV đối với cơ thể. Ngoài ra, sự ức chế DNJ chống lại vi rút bệnh bạch cầu chuột Molony (MoLV) cho thấy DNJ có hoạt tính chống retrovirus đáng kể với IC50 là 1.2-2.5 μg / mL, và sự ức chế tăng lên khi tăng liều DNJ. Steinmann E và cộng sự. phát hiện ra rằng HCV nhanh chóng bị tiêu diệt sau khi thêm chuỗi alkyl dài DNJ vào môi trường nuôi cấy tế bào nhiễm HCV, cho thấy DNJ là một loại thuốc tiềm năng để điều trị viêm gan siêu vi C.
Một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng DNJ có nhiều chức năng hoạt động khác nhau, bao gồm hạ đường huyết, ức chế sự di căn của khối u và hoạt động kháng vi-rút, khiến nó trở thành điểm nóng của nghiên cứu hiện nay. Dâu tằm là một trong những loài có hàm lượng 1-DNJ tương đối cao, nhưng nó bị hạn chế bởi quá trình sản xuất chiết xuất và tinh chế. Việc phát hiện ra gen quy định tổng hợp DNJ ở chủng Bacillus 3K85 cũng tạo cơ sở cho quá trình tổng hợp DNJ trên quy mô lớn của vi sinh vật. Hiện nay, bột 1-DNJ tự nhiên đã trở thành một điểm nóng trong nghiên cứu.
