I. Đặt vấn đề
Việc nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của các dược liệu trên mức độ tế bào in vitro mang tính khoa học và xác thực hơn so với các thử nghiệm trong môi trường không tế bào. Theo nhiều tài liệu đã công bố, trong những năm gần đây, các stress oxy hoá đóng góp nhất định vào tình trạng mất tế bào miễn dịch ở nhiều điều kiện bệnh lý như ung thư, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, hoặc bệnh lý người cao tuổi. Để đánh giá chức năng sống của tế bào, kỹ thuật MTT hiện đang được áp dụng phổ biến nhất ở các labo nuôi cấy tế bào thuộc các nước phát triển[1,2,3,4,5]. Kỹ thuật MTT được dựa trên nguyên tắc là MTT [3- (4,5- dimethylthiazol – 2- yl) – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid] tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Có thể dùng một số dung dịch khác nhau để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét khả năng áp dụng kỹ thuật MTT để đánh giá tác dụng của một số dịch chiết từ dược liệu đến chức năng sống của tế bào lympho chịu stress oxy hoá.
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu thực vật: Nguyên liệu nghiên cứu là phần chiết từ ethyl acetat bay hơi hết dung môi, cắn hoà tan trong PBS, các dịch chiết này đã được xác định là có hoạt tính chống oxy hoá từ hà thủ ô, cúc hoa vàng. Các dịch chiết được chuẩn bị ở nồng độ nhất định và được lọc vô khuẩn qua phễu lọc trước thí nghiệm.
2.2. Hoá chất: Tác nhân gây độc tế bào là H2O2. Từ H2O2 30% chuẩn bị dung dịch H2O2 10-1M. Sau đó H2O2 được pha loãng đến các nồng độ từ 10-3 đến 10-6M trong PBS. Lọc vô khuẩn dung dịch H2O2 10-3M bằng phễu lọc sau đó đã pha loãng tiếp dung dịch này bằng PBS đã vô khuẩn, trong buồng hút vô trùng Laminar. Tất cả các dịch pha loãng này đều được chuẩn bị ngay trước thí nghiệm với tế bào.
MTT: 3- (4,5- dimethylthiazol – 2- yl) – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid] (hãng Sigma), được chuẩn bị ở dung dịch 5mg/ml trong PBS, bảo quản trong lọ bọc giấy bạc và giữ ở 180C.
SDS (Sodium dodecyl sulfat) và DMF (Dimethyl formamid) được pha như sau: Hoà tan 20g SDS trong 100ml dung dịch DMF 50% trong nước cất, điều chỉnh pH của dung dịch đến 4,2.
PBS (Phosphate Buffered Saline tablets, Sigma), 1 viên hoà trong 200ml nước cất sẽ cho một dung dịch PBS 0,01M, pH 7,4.
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium.
2.3. Phân lập tế bào lympho
Chọn 3 – 5 chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, có trọng lượng 22 ± 1g, do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp. Mổ chuột, lấy lách chuột trong phòng vô khuẩn. Cắt bỏ các tổ chức mỡ nếu có bao quanh lách. Đặt lách chuột vào môi trường DMEM, cắt nhỏ lách thành các mảnh nhỏ khoảng 1mm3. Sau đó, dùng dụng cụ chuyên dùng để nghiền nhẹ và tách lấy tế bào lách qua mắt rây của dụng cụ đó. Thu hỗn dịch tế bào và đặt trong PBS. Ly tâm rửa tế bào ở 2000v/phút/10phút/40C, 2 lần. Loại bỏ dịch nổi, thêm vào cặn tế bào 1ml PBS và 4ml nước muối đẳng trương. Làm đều huyền dịch. Ly tâm 500vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ các xơ sợi trong nước nổi. Treo lại tế bào trong 2ml PBS. Đếm tế bào bằng buồng đếm Newbauer. Sau đó, thêm PBS để có nồng độ tế bào là 6 x 106tế bào/ml. (Thường từ 5 chuột có thể thu được 25ml dịch tế bào có nồng độ trên).
Cho vào mỗi giếng nuôi cấy 0,8ml chứa 6 x 106tế bào/ml, lặp lại mỗi 3 giếng cho một loại thử nghiệm. Trong các giếng thử nghiệm, thể tích tổng số là 1ml gồm 0,8ml huyền dịch tế bào, 0,1ml dung dịch H2O2và 0,1ml dịch chiết.
2.4. Quy trình thử tác dụng gây độc tế bào bằng H2O2 và nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch chiết
a. Xác định các nồng độ gây độc tế bào
Các dung dịch H2O2 được chuẩn bị ở các nồng độ giảm dần và đưa vào các giếng nuôi cấy, mỗi giếng 0,2ml để có nồng độ cuối cùng trong các giếng từ 10-6M đến 10-3M. Thể tích toàn bộ trong mỗi giếng là lml. Mỗi nồng độ H2O2 được lặp lại trong 4 giếng liền nhau.
Sau khi cho H2O2 vào môi trường nuôi cấy, đặt phiến nuôi cấy trong tủ ấm nuôi cấy tế bào ở 370C trong môi trường không khí ẩm chứa 5% CO2, thời gian 1 giờ. Sau đó ly tâm phiến nuôi cấy, 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, loại bỏ môi trường. Rửa tế bào 2 lần nữa bằng ly tâm, dùng 1ml PBS cho vào mỗi giếng.
Đặt lại tế bào trong 1ml PBS. Thêm vào mỗi giếng 100ml MTT 5mg/ml và ủ ở 370C trong 2 giờ. Sau đó loại môi trường có chứa MTT bằng cách dùng pipet, hoà tan cắn tế bào bằng 1ml SDS/DMF, đặt trong tủ 370C/ 10phút, lắc 10 phút, lặp lại 2 lần. Tạo dung dịch đồng nhất bằng cách dùng pipet nhựa, bơm nhẹ dung dịch. Đo độ hấp thụ của dung dịch trên máy ELx 800 ở 570nm.
Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với độ hấp thụ DO.
b. Xác định tác dụng bảo vệ của dịch chiết
Dịch chiết được chuẩn bị để đưa vào các giếng đã có chứa tế bào, không hoặc có chứa H2O2 ở các nồng độ khác nhau, bù môi trường vào các giếng để có thể tích dung dịch trong mỗi giếng là 1ml. Nồng độ cuối cùng của dịch chiết trong hỗn hợp tế bào được tính theo 0,1ml dịch chiết đã được chuẩn bị trước. Mỗi giếng thí nghiệm chứa 0,8ml
huyền dịch tế bào, 0,1ml H2O2 và 0,1ml dịch chiết.
Các bước tiếp theo được tiến hành như mô tả ở phần (a).
Xử lý kết quả bằng phần mềm tính thống kê Statview 4.5.
